霉菌培養箱在金針菇中的作用！

來源：未知發布日期：2019-07-26 16:37【大中小】

本文對影響金針菇原生質體制備和再生的因素進行研究,并篩選出金針菇原生質體制備和再生的最佳條件,為采用細胞工程技術培育金針菇優良菌種打下了基礎。

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不同的接種方法對原生質體的再生有很大的影響,本實驗上海博訊分別采用直接涂抹法和雙層培養法進行實驗,雙層培養法幾乎沒有菌落再生。原因可能是冬季操作,雙層培養基的上層半固體培養基溫度難以控制,致使原生質體死亡。

原生質體雖然失去了細胞壁存在時的原有細胞形態,變成了圓球體,但它仍然具有原生質膜和整體基因組,仍保持著細胞的生理學、生化學和遺傳學的特性和功能,并能再生和回復成一個具壁細胞,因此已成為生理學和遺傳學的研究材料。影響原生質體形成的因素很多,本文上海博訊比較了酶濃度、酶系組合、滲透壓穩定劑及酶解時間等因素的影響。用酶法破壁制取原生質體,酶的作用無疑是關鍵,不同種或者同一種不同分布區域的菌體由于其細胞壁的結構可能存在差異而需要不同的酶系統,而且,酶的質量、純度對原生質體的形成也有著非常大的影響。真菌細胞壁是由幾丁質、纖維素和無定型葡聚糖層組合的復合體,因此在一般情況下,采用具有分解幾丁質、纖維素的裂解酶即能制備出原生質體。

本實驗上海博訊采用纖維素單酶進行裂解,發現需時較長,而且產量很低。采用纖維素酶與其它酶的混合體系則大大縮短了酶解時間,原因可能在于不同酶之間存在作用的互補。本實驗上海博訊篩選出的最佳酶系組合是纖維素酶與溶菌酶的混合,并且分別以1%的濃度混合較為適宜。濃度過高,易造成原生質體不穩定而變形,甚至破裂,產量反而下降也不經濟;濃度太低,破壁困難則原生質體產量不足。滲透壓穩定劑作為裂解酶的作用環境和原生質體的存在環境,對原生質體的釋放和再生產生重要的影響。穩滲劑的性質、濃度一定程度上會促進酶的反應活性,同時也是維持和控制原生質體數量的主要因素。常用的滲透壓穩定劑有無機型和有機型兩大類,對食用菌來說,滲透壓穩定劑用無機鹽似乎比有機型的要好。這可能與絲狀真菌原生質體為保持代謝活性利用醇、糖而改變周圍環境,包括pH、滲透壓以至改變穩定性,從而影響破壁效果有關,這與本實驗的結果一致,并且以KCl為穩滲劑的效果最好,可以獲得最高產量且原生質體比較穩定。

本次實驗選用的三種無機鹽類穩滲劑KCl、NaCl、MgSO4·7H2O對原生質體的再生沒有明顯不同的影響,但是作者在實驗中發現采用MgSO4·7H2O作穩滲劑的培養基凝固性差。酶解時間也是影響原生質體釋放的重要因素。上海博訊本實驗結果表明,25℃下,酶解1.5h獲得的原生質體最多,大小也比較均勻,隨著酶解時間的延長,原生質體數量開始減少,主要原因可能是酶繼續作用于膜系統使膜破裂所致。另外在酶解過程中,要間隔一段時間伴以輕微振蕩,以利于原生質體與菌絲體分離開來。此外,酶解溫度和菌絲體的菌齡對原生質體的釋放也產生了很大的影響。酶解溫度主要影響酶的活力和菌體的生理狀態,由于金針菇菌絲生長的最適溫度是25℃,纖維素酶和溶菌酶的酶活性最適溫度為25～35℃之間,所以作者采用的酶解溫度為25℃。菌絲體的菌齡對原生質體釋放的影響主要在于細胞壁的成份和結構發生了變化。酶解時,首先菌絲頂端見到原生質體釋放,因為尖端部分是新合成的壁,成分相對簡單,壁也相對薄些。隨著菌齡的增加,壁不斷沉積色素等物質,阻礙了酶的作用,使壁難以解體釋放原生質體。

在本實驗中,上海博訊采用搖瓶培養的菌絲生長較快,4d即可獲得大量菌絲。但是作者在實驗過程中發現金針菇菌絲在搖瓶培養時易團化,另外分泌粘性物質很多,不利于洗滌和酶解。因此采用搖瓶培養的菌絲制備原生質體時,應先采取措施使菌團充分散化,使菌絲細胞壁外露,以利于隨后的振蕩洗滌及各種裂解酶的滲入而起作用。這將在以后的實驗中進一步探討。而采用玻璃紙平板培養的菌絲雖然生長較慢,10d才能得到適用的菌絲,但制取原生質體方便,效果較好。同樣,影響原生質體再生的因素有很多本文進行了培養基、滲穩劑、接種方法等因素的影響的研究。培養基成分不同會導致新合成的細胞壁結構的差異,這種差異又導致了對酶敏感度反應不一,從而使菌絲細胞釋放的原生質體再生有差異。

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