0 引言

昆蟲穴蟻（Myrmeleon sp），其幼蟲俗稱蟻獅， 屬脈翅目昆蟲。具有化瘀通竅、利水通便、退瘡 祛痰等療效，可用于治療骨髓炎、中耳炎、脈管炎 等。我國對(duì)蟻嶺幼蟲的研究可追溯到明朝，李 時(shí)珍在1578年撰寫的《本草綱目》中就記載了蟻 獅可入藥，其后的很多醫(yī)書也闡述了蟻獅作為中 藥對(duì)治療疾病的功效（周漢輝等，2000），近年來 對(duì)蟻獅藥用價(jià)值的深度開發(fā)仍在繼續(xù)。目前治 療心血管病的藥物多為人工合成的西藥，大多具 有難以克服的缺點(diǎn)和不良副作用，而天然藥物常 具低毒性無副作用的優(yōu)點(diǎn)。因此利用蟻獅研發(fā) 治療和預(yù)防心血管病的新藥，前景極為廣闊。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

蟻獅：購自野生活體金沙牛直銷店；磷酸二 氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉：天津 市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銨：天津市福晨化學(xué)試 劑廠；三（羥甲基）氨基甲烷試劑：天津市大茂化 學(xué)試劑廠；鹽酸：西隴化工股份有限公司；氯化 鋇：上海山浦化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈉：天津 市大茂化學(xué)試劑廠；聚乙二醇10000：天津市大茂 化學(xué)試劑廠；D34mm透析袋：上海源葉生物技術(shù) 有限公司；氯化鉀：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧 化鈉：西隴化工股份有限公司；瓊脂糖：GENE COMPANGY；碳酸氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠； 磷酸二氫鉀：天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋 白：北京索萊寶科技有限公司；尿激酶：中國食品 藥品檢定研究所；牛凝血酶：中國食品藥品檢定 研究所；牛血清蛋白：北京索萊寶科技有限公司； 無水氯化鈣：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銅：天 津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鎂：天津市大茂化學(xué) 試劑廠；硫酸錳：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化 鋅：天津市大茂化學(xué)試劑廠；十二烷基硫酸鈉 （SDS）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙二醇-雙-(2- 氨基乙醚)四乙酸（EGTA）：上海展云化工有限公 司；L-半胱氨酸酸鹽一水：天津市大茂化學(xué)試劑 廠；巰基乙醇（βME）：西隴化工股份有限公司；一 水合檸檬酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；甘氨酸：天 津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-2型恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新涇儀器 有限公司；AUY220電子分析天平：梅特勒-上海； 高速冷凍離心機(jī)：熱電（上海）科技儀器有限公 司；DHG-9076A型電熱型恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海 精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WFZ—UV-2000型紫外 可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司； 微量移液器：德國Eppendorf公司；博迅生化培養(yǎng)箱：上 海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 粗蛋白的提取

將蟻獅從沙子里揀出，洗凈，瀝干，稱量，冰 凍致死；研磨后，加入適量預(yù)冷PBS（pH 7.4）浸沒 勻漿，4℃浸提24h。取浸提液，4℃，10000r/min條 件下離心15min，去沉淀，合并上清液。采用硫酸 銨鹽溶液飽和度的方法，對(duì)所得蟻獅粗提液進(jìn) 行分段鹽析，得到0~35%、35%~70%、70%~100% 的目的蛋白，收集沉淀。將各鹽析段沉淀分裝入 預(yù)處理好的透析袋中，先用雙蒸水透析4h，再用 Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）透析，透析過程中多次更換緩沖液，直至緩沖液用氯化鋇溶液檢測(cè)不出 白色沉淀為止。透析后加入聚乙二醇進(jìn)行濃縮， 濃縮后將透析袋中待測(cè)液取出，分裝后置 4℃保 存?zhèn)溆谩?br />
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

打開超凈工作臺(tái)，紫外照射 0.5h 后，放入已 準(zhǔn)備好的纖維蛋白凝膠平板等實(shí)驗(yàn)耗材，用孔徑 為0.6cm的已滅菌槍頭的較大一端在板上打孔并 提前做好標(biāo)記。按標(biāo)記的順序每孔依次按表2加 入不同濃度的尿激酶溶液各20μL，并留一孔加入 PBS溶液20μL作為陰性對(duì)照，待加樣完成后，小 心平移將平板取出，用保鮮膜包好，于 37℃恒溫 培養(yǎng)箱中孵育20h左右。到時(shí)間后取出平板，每 板倒入考馬斯亮藍(lán)染液約10mL進(jìn)行染色，10min 左右，然后先用蒸餾水多次沖洗平板至蒸餾水無 色后，換用洗脫液沖，至溶圈清晰可見即可。用 刻度尺測(cè)量溶圈的垂直直徑，每孔測(cè)量兩次，取 平均值，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所得溶圈的面積。

2.3 纖溶活性的測(cè)定

采用纖維蛋白平板法測(cè)定提取的蛋白粗提 液是否有纖溶活性。 纖維平板的制作：取 0.6g 瓊脂糖于錐形瓶 中，加入 72mLPBS 緩沖液滅菌后冷卻至 50℃左 右，再加入3mL牛血纖維蛋白原、120μL凝血酶， 迅速搖勻并倒平板，將倒好的平板 4℃保存?zhèn)?用。檢測(cè)時(shí)取出平板，用 200μL 槍頭打孔后加 樣，放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h，再進(jìn)行染色、 脫色，如有纖溶活性，即可觀察到藍(lán)色平板上的 透明溶圈。

2.4 蛋白濃度的測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定使用BCA蛋白定量法，以牛血 清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。 稀釋BCA標(biāo)準(zhǔn)品：與待測(cè)蛋白樣品相一致的 稀釋液按表1稀釋BCA標(biāo)準(zhǔn)品。

3 結(jié)論

采用硫酸銨分段鹽析法分離提取出蟻獅纖溶活性蛋白，通過纖維平板法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) 0%~35%、35%~70%、70%~100%三個(gè)段的蟻獅的 粗蛋白都具有與 UK 相媲美的纖溶活性，甚至高 于 UK。蟻獅粗蛋白經(jīng)一系列理化性質(zhì)研究，結(jié) 果表明，最適溫度為37℃，最適pH為6。



 

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