0 引 言

蛋白胨（peptone）是由?、胨、肽和氨基酸組成 的水溶性混合物，是微生物生長(zhǎng)發(fā)育和繁衍的重要 氮素營(yíng)養(yǎng) 。隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和人們 對(duì)微生物發(fā)酵技術(shù)的重視，蛋白胨的用量逐年增大。 雖然蛋白胨的生產(chǎn)路線短、工藝簡(jiǎn)單，但其貨源仍舊 比較緊張，價(jià)格昂貴。開(kāi)發(fā)新的蛋白胨資源和研 究新的制備工藝意義重大。蛋白胨不僅可用于微生 物培養(yǎng)基制備，還是醫(yī)藥生產(chǎn)、商品檢驗(yàn)、衛(wèi)生防疫、 臨床化驗(yàn)和疫苗、毒素等生物制品生產(chǎn)及菌種培養(yǎng) 分離與鑒別的重要生化試劑 。

1 材料與方法

1. 1 供試材料與主要試劑

枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）為本實(shí)驗(yàn)室保 藏菌種；瓊脂粉，上海山浦化工有限公司，生化級(jí)；牛 肉膏和胰蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司，生化 級(jí)；酪蛋白，上海伯奧生物科技有限公司，生化級(jí)； NaOH、KH2PO4、NaCl、H2SO4、CuSO4、K2SO4、 Li2SO4、HCHO、Na2WO4·2H2O、Na2MoO4·2H2O、氨 基苯磺酸?α?萘胺、苯酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；胃蛋白酶、堿性蛋白酶，廣西龐博生物工 程有限公司，生化級(jí)。

1. 2 主要儀器與設(shè)備

DK?98?11A 型電熱恒溫水浴箱，天津市泰斯特 儀器有限公司；UV ?2500 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津；IRPrestige?21 島津傅立葉變換紅外光譜儀， 日 本 島 津 ；HERMLE Z323K 冷 凍 離 心 機(jī) ，德 國(guó) Hermle 公司；PHS ?3C 型 pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠； AL204 分析天平，梅特勒?托利多；DF ?101S 集熱式 恒 溫 加 熱 磁 力 攪 拌 器，鄭 州 予 華 儀 器 制 造 有 限 公 司；上海博迅YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器；L550?臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀 器有限公司；KDN ?08C 凱氏定氮儀，杭州托普儀器 有限公司。

1. 3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1 冷榨花生粕蛋白胨的制備工藝

準(zhǔn)確稱取脫脂冷榨花生粕 5 g 溶解于 250 mL 去 離子水中，用鹽酸調(diào) pH 至 2. 0，加入 5% 的胃蛋白酶 （以底物為基準(zhǔn)，3 000 U/g）并于 37 ℃攪拌條件下酶 解 200 min，定 期 監(jiān) 測(cè) 其 水 解 度（degree of hydroly? sis，DH%）變化；水解完成后，將水解液用 NaOH 調(diào) 節(jié) pH 至 8. 0，加入 2% 堿性蛋白酶（以底物為基準(zhǔn)， 50 000 U/g），于 50 ℃攪拌條件下酶解 190 min，定期 監(jiān)測(cè) DH%；水解全部完成后將酶解液置于沸水浴 中 10 min 滅酶。冷卻至室溫后于 4 ℃，5 000×g 離 心 25 min，取上清液冷凍干燥，即冷榨花生粕蛋白胨 （cold?pressed peanut meal peptone，CPMP）。

1. 3. 2 一般性狀檢查

①顏色、澄清度和沉淀檢查 準(zhǔn)確稱取 1. 0 g 花生蛋白胨放入 50 mL 去離子 水中（100 mL 燒杯），加熱煮沸使其溶解。冷卻至室 溫后觀察溶液顏色、澄清度和沉淀 。結(jié)果判定標(biāo) 準(zhǔn)：顏色分為無(wú)色、微黃、淺黃、黃色、深黃、淺棕和棕 色；澄清度分為澄清、微混和混濁；沉淀分為無(wú)、微 量、少量和多量。以細(xì)菌胰蛋白胨為標(biāo)準(zhǔn)。
②堿性沉淀檢查 準(zhǔn)確稱取 2. 0 g 花生蛋白胨，加入 100 mL 去離 子水于 250 mL 三角瓶中，用 0. 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 8~9，121 ℃高壓滅菌 30 min，冷卻至室溫后觀察 溶液澄清度和沉淀情況 。
③磷酸鹽沉淀檢查 準(zhǔn)確稱取 2. 0 g 花生蛋白胨、KH2PO4 0. 5 g，加入 100 mL 去 離 子 水 于 250 mL 三 角 瓶 中 ，用 0. 1 mol/L NaOH 調(diào) 節(jié) pH 7. 4~7. 6，121 ℃ 高 壓 滅 菌 30 min，冷 卻 至 室 溫 后 觀 察 溶 液 澄 清 度 和 沉 淀 情況 。
④ pH 值測(cè)定 準(zhǔn)確稱取 1. 0 g 花生蛋白胨，加入 50 mL 去離子 水，加熱煮沸后使其溶解，冷卻至室溫，用 pH 計(jì)測(cè)定 溶液 pH 值。

1. 3. 3 蛋白胨化學(xué)指標(biāo)測(cè)定

水分含量測(cè)定根據(jù) GB 5009. 3-2016 測(cè)定； 灰分根據(jù) GB 5009. 4-2016 測(cè)定 ；總氮采取微量 凱氏定氮法測(cè)定 ；氨基氮含量采取甲醛滴定法測(cè)定 ；蛋白胨含量采取雙縮脲法測(cè)定 ；糖含量采取 苯酚硫酸法；亞硝酸鹽法采取氨基苯磺酸?α?萘胺試 液測(cè)定；磷含量采取比色法（測(cè)定波長(zhǎng) 820 nm）測(cè) 定 。氯化鈉含量采取滴定法測(cè)定 。

1. 3. 4 枯草芽胞桿菌增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

Luria?Bertani 培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基）配方：胰蛋白 胨 10. 0 g，酵 母 提 取 物 5. 0 g，NaCl 10. 0 g，用 950 mL 去 離 子 水 溶 解 后 用 5 mol/L NaOH 調(diào) 節(jié) pH 至 7. 0，用 去 離 子 水 定 容 至 1 000 mL，121 ℃ 滅 菌 20 min，冷卻至室溫，備用。 將胰蛋白胨用含氮量相等的冷榨花生粕蛋白胨 （CPMP）代替（12. 0 g），其他操作步驟相同，制備得 到的培養(yǎng)基稱為冷榨花生粕蛋白胨培養(yǎng)基（CPMP 培養(yǎng)基）。將 37 ℃已活化培養(yǎng) 24 h 的枯草芽胞桿菌 菌種斜面全部轉(zhuǎn)移至 100 mL 無(wú)菌水中，用玻璃珠分 散均勻，并稀釋至 1×10-3，備用；無(wú)菌條件下用吸液 管吸取 1. 0 mL 菌液分別接種至 LB 培養(yǎng)基和 CPMP 培養(yǎng)基，裝瓶量為 100 mL（250mL 三角瓶），37 ℃培 養(yǎng) 36 h，定期監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液 pH 和 600 nm 條件下的吸 光值（A600 nm），以 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的枯草芽胞桿菌作 為對(duì)照，評(píng)價(jià) CPMP 培養(yǎng)基對(duì)枯草芽胞桿菌增殖的 影響。

2 結(jié)果與分析 

通常情況下，蛋白胨的顏 色 一 般 不 能 太 深，否 則 會(huì) 影 響 微 生 物 的 生 長(zhǎng) 和 繁 殖 ，如果顏色較深，則需要進(jìn)行脫色處理。研究 者用微生物發(fā)酵法發(fā)酵熱榨花生粕制備花生蛋白胨 時(shí)發(fā)現(xiàn)，熱榨花生粕蛋白胨顏色較深，呈淺棕色 ， 主要是由于花生粕熱榨工藝使花生色素浸出較多， 高溫條件下的美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)也加深了熱 榨花生粕的顏色 。在澄清度和沉淀檢測(cè)項(xiàng)中，冷 榨花生粕蛋白胨與蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，均澄清 透明且無(wú)沉淀，全部溶解。作為一種重要的微生物 培養(yǎng)生物化學(xué)試劑，蛋白胨的澄清透明是首要標(biāo)準(zhǔn)， 因?yàn)樵谖⑸锱囵B(yǎng)過(guò)程中常需要進(jìn)行微生物生長(zhǎng)情 況的觀測(cè)，若蛋白胨溶液呈現(xiàn)混濁或有沉淀易導(dǎo)致 觀測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確 ；在 pH 檢測(cè)項(xiàng)中，冷榨花生粕 蛋白胨與蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)品 pH 較為接近，均在 pH 7. 0 左右；堿性沉淀與磷酸鹽沉淀均未檢測(cè)到，能滿足微 生物的生長(zhǎng)要求。蛋白胨在微生物生長(zhǎng)或產(chǎn)物合成中主要是作為 提供氮源的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，因此，含氮量是蛋白胨重要的 質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。高質(zhì)量細(xì)菌蛋白胨總氮要求達(dá)到 14. 5% 以上，植物蛋白胨由于含糖量相對(duì)較高，其 總氮應(yīng)不低于 8. 5% 。對(duì)冷榨花生粕蛋白胨進(jìn) 行了總氮含量測(cè)定，結(jié)果為（15. 08±0. 49）%，表明 冷榨花生粕的總氮含量較高，有利于促進(jìn)微生物的 生長(zhǎng)，符合高質(zhì)量生化試劑蛋白胨的質(zhì)量要求。

3 結(jié)論與討論

參考《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》和《中國(guó)生 物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)蛋白胨進(jìn)行質(zhì)量 評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，冷榨花生粕蛋白胨顏色為淺黃色， 2% 蛋白胨溶液澄清透明，無(wú)沉淀，pH 呈中性，無(wú)堿 性沉淀與磷酸鹽沉淀，含水量為（4. 16±0. 35）%，灰 分 含 量 為（10. 35±1. 03）% ，總 氮 含 量 為（15. 08± 0. 49）%，氮基氮含量為（2. 503±0. 45）%，含糖量為 （2. 63±0. 14）%，不含亞硝酸鹽，磷含量為（0. 073± 0. 15）%，NaCl 含量為（0. 86±0. 02）%，符合生化蛋 白胨的質(zhì)量要求。將冷榨花生粕蛋白胨與胰蛋白胨在枯草芽胞桿菌增殖培養(yǎng)時(shí)無(wú)顯著差異（p>0. 05）。


 

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