近年來，大豆異黃酮因為其潛在的抗腫瘤生 物活性而受到研究者廣泛關注。大豆異黃酮的結 構與內源性雌激素相似，具有弱雌激素效應，被稱 為植物雌激素。大豆異黃酮對乳腺癌、前列腺癌 等雌激素依賴性腫瘤的抑制作用已經得到廣泛證實。隨著研究的深入，研究者發(fā)現大豆異黃 酮對非傳統(tǒng)意義上的雌激素依賴性腫瘤也有抑制 作用，如大腸癌。

1 材料與方法

1. 1 儀器與試劑

外消旋雌馬酚及其對映異構體( 純度＞99%) 購于 美 國 LC Laboratories 公 司，雌 激 素 受 體 ［estrogen receptor，EＲα ( SC-542 ) ］、EＲβ ( SC8974) 、β-actin ( SC-47778) 和核因子紅系 2 相關 因子 2［nuclear factor ( erythroid-derived 2) -like 2， Nrf2］抗體購自美國 Santa Cruz Biotecnology 公司， 二抗抗體購自愛爾蘭 Ｒockland 公司，胰酶、胎牛 血清、細胞培養(yǎng)基購于美國 Invitrogen 公司，蛋白 提取、定量及蛋白免疫印跡相關材料試劑購自美 國 Bio-rad 公司，3-( 4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯 基四氮唑溴鹽［3-( 4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5- diphenyltetrazolium bromide，MTT］試劑購于美國 Sigma 公司，雌激素受體( estrogen receptor，EＲ) 抑 制 劑 ( ICI182780 ) 、EＲα 激 動 劑 ［1，3，5-tris ( 4-hydroxyphenyl ) -4-propyl-1Hpyrazole，PPT］和 EＲβ 激動劑( diarylpropionitrile，DPN) 購于美國 Sigma 公司。酶聯(lián)免疫檢測儀為美國 Thermo 公 司產品。

1. 2 細胞培養(yǎng)

人大腸癌 HCT15 細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學細胞中心，用含 10%胎牛血清的 1640 培 養(yǎng)基，在 5% CO2、37 ℃博訊常溫培養(yǎng)箱（上海博訊BPX-272）中培養(yǎng)。 

1. 3 細胞增殖檢測

對數生長期的 HCT-15 細胞，胰酶消化后，用 含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔 2 ×103 個細胞接種到 96 孔板，每孔體積 100 μL。 相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 24 h 至細胞貼壁。根據前 期研究，加入含 0、0. 5、1、5 和 10 μmol /L 外消旋雌馬酚或雌馬酚對映異構體的培養(yǎng)液 100 μL， 每個濃度設置 10 個復孔。培養(yǎng) 24、48、72 和 96 h 后，加入 10 μL MTT，繼續(xù)孵育 1. 5 h 后終止。在 570 nm 和 650 nm 波長處測定吸光度( A) 。計算 HCT-15 細胞的增殖率( proliferation rate，PＲ) 和抑 制率( inhibition rate，IＲ) ，計算公式為: 增殖率 = A570－A630，抑制率= ( 增殖率對照組 －增殖率實驗組 ) /增 殖率對照組 ×100%。

1. 4 蛋白質表達水平測定

將對數生長期的 HCT-15 細胞用含 10%胎牛 血清的培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔 5×104 個細 胞接種到 6 孔板，每孔體積 2 mL。過夜后加入 0、 0. 5、1、5 和 10 μmol /L 外消旋雌馬酚或其對映異 構體，48 h 后 加 入 含 1 mol /L 苯 甲 基 磺 酰 氟 ( PMSF) 的細胞裂解液，冰上裂解 30 min 后，4 ℃， 12 000 r /min 離心 5 min 取上清，用聚氰基丙烯酸 正丁酯( butyleyanoacrylate，BCA) 蛋白濃度測定法 進行定量。50 μg 總蛋白等量上樣，10%聚丙稀銑 胺凝 膠 電 泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE) 分離蛋白，濕法轉至聚偏氟乙烯膜。5%脫 脂奶室溫封閉 2 h 后，EＲα、EＲβ、Nrf2 和 β-actin 一抗用 5%脫脂奶 1 ∶200 稀釋，4 ℃ 孵育過夜。用 TBST 緩沖液( tris buffered saline，with tween-20， pH 8. 0) 漂洗 3 次后加入二抗，室溫孵育 1 h，使 用增強熒光發(fā)光試劑顯影，然后使用圖像成像系 統(tǒng)檢測條帶。

1. 5 統(tǒng)計學分析

用 SPSS 22. 0 統(tǒng)計軟件進行分析，多組間比 較用方差分析，進一步兩兩比較采用 SNK 檢驗， 顯著性水準 α = 0. 05。

2 結果

外消旋雌馬酚及( Ｒ) 雌馬酚可 以抑制大腸癌 HCT-15 細胞的增殖( P＜ 0. 05) ，且 隨著劑量增加抑制作用增強，而( S) 雌 馬 酚 對 HCT-15 細胞的增殖沒有明顯影響( P＞0. 05) 。外消旋雌馬酚和( Ｒ) 雌馬 酚對 HCT-15 細胞增殖的抑制率呈先上升后回落 的趨勢，在第 3 天左右達到最大，此時外消旋雌馬 酚的 IC50 為 59. 6 μmol /L，( Ｒ) 雌 馬 酚 的 IC50 為5. 1 μmol /L。此外，Nrf2 蛋白表達也隨外消 旋雌馬酚濃度的增加而增加。( Ｒ) 雌馬酚刺激 HCT-15 細胞后，Nrf2 蛋白表達隨其濃度的增加而 增加，但未發(fā)現 EＲ 表達水平受到影響。

3 討論

有研究報道大豆異黃酮的攝入可以減少大腸癌的發(fā)病風險，但是大豆異黃酮的代謝產物雌馬 酚，尤其是雌馬酚對映異構體對大腸癌的影響少 有研究。本研究以大腸癌 HCT-15 細胞為研究對 象，探討了外消旋雌馬酚及雌馬酚對映異構體對 大腸癌細胞增殖的影響及其機制。結果顯示，外 消旋雌馬酚可通過上調 EＲβ 和 Nrf2 表達來抑制 HCT-15 細胞增殖，( Ｒ) 雌馬酚可通過上調 Nrf2 表 達來抑制 HCT-15 細胞增殖，( S) 雌馬酚對 HCT15 細胞增殖沒有影響。