幽門螺桿菌是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的重要致病因子。目前，臨床對幽門螺桿菌感染治療大多是經(jīng)驗用藥，隨著感染人群中幽門螺桿菌耐藥菌株的 不斷增加，經(jīng)驗性用藥治療失敗率越來越高。為指導(dǎo) Ⅰ期臨床用藥，提高幽門螺桿菌治療精準(zhǔn)性、敏感性， 迫切需要實驗室提供幽門螺桿菌培養(yǎng)和藥敏 結(jié) 果。 由于幽門螺桿菌需要在微需氧的特殊環(huán)境和較高營 養(yǎng)條件生長，實驗室培養(yǎng)成功率較低，使得許多醫(yī)院 都不愿開展幽門螺桿菌培養(yǎng)。近幾年來國內(nèi)許多第 三方醫(yī)學(xué)檢驗機構(gòu)針對臨床需求，紛紛開展幽門螺桿 菌培養(yǎng)和差異化服務(wù)。

１ 材料與方法

１．１ 儀器與試劑

１．１．１ 培養(yǎng)液種類

幽門螺桿菌轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基（固－液 雙相）購自珠海經(jīng)濟特區(qū)益民生物工程制品廠（批號： ２０１８０７３０）；血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份 有限公司（批號：２０１８０７２６Ｂ）；苛養(yǎng)菌藥敏瓊脂平板購 自 鄭 州 安 圖 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 （批 號： ２０１８０７１９Ｂ）。

１．１．２ 鑒定試劑

ＶＩＴＥＫ ＭＳ－ＣＨＣＡ 基質(zhì)購自生 物梅里埃公司（批號：１００６０６２９８０）；尿素酶購自杭州 濱和微生物試劑有限公司（批號：１７０１０３）；觸酶和氧 化酶購自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司（批號分別為： １８Ｄ０８０４和１８Ｄ１８０５）。

１．１．３ 儀器

梅里埃質(zhì)譜儀 ＶＩＴＥＫ ＭＳ購自生物 梅里埃公司；ＴＤＲ－Ｙ１００型微需氧培養(yǎng)儀和微需氧培 養(yǎng)氣體（１０％二氧化碳＋１０％氫氣＋氮氣平衡氣）購 自湖南長沙天地人生物科技有限公司；標(biāo)本運輸箱購 自廣州賽信冷鏈冷藏科技有限公司；博迅YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器（非醫(yī)用）； ＨＳＸ－２５０型電熱恒溫恒濕箱購自中儀國科（北京）科 技有限公司；ＤＷ－８６Ｌ３３８型－８０ ℃超低溫保存箱購 自青 島 海 爾 特 種 電 器 有 限 公 司；ＤＷ－ＹＷ１６６Ａ 型 －２５ ℃冰箱購自中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司； ＤＷ－ＹＬ４５０型４ ℃冰箱購自中科美菱低溫科技有限 責(zé)任公司；ＢＳＣ－１５００ＩＩＢ２－Ｘ型生物安全柜購自山東濟 南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；ＣＸ２１ＦＳ１Ｃ 型生物顯微 鏡和 ＢＸ４３Ｆ型攝像顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

１．２ 方法

１．２．１ 樣本制備原代幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

ＡＴＣＣ４３５０４以 ＴＳＢ基質(zhì)配制濃度為０．５麥?zhǔn)蠞岫鹊?菌懸浮液（約１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ）。按以下步驟進行連 續(xù)稀釋，（１）１∶００稀釋：吸取上述細(xì)菌懸液０．１ ｍＬ 加入９．９ｍＬＴＳＢ中。（２）再１∶１００稀釋：吸經(jīng)（１）稀 釋后懸液０．１ｍＬ 加入９．９ｍＬ ＴＳＢ 中。（３）再１∶ １００稀釋：吸經(jīng)（２）稀釋后懸液０．１ｍＬ 加入９．９ｍＬ ＴＳＢ中。此 時 幽 門 螺 桿 菌 濃 度 為 （１００±１０）ＣＦＵ／ ｍＬ，然后將此濃度的幽門螺桿菌菌液加入運輸培養(yǎng) 基中，每支１ｍＬ，共７５支。此試驗重復(fù)３次。

１．２．２ 樣本包裝

將標(biāo)本放置于特殊包裝箱中。包 裝箱必須具備，
（１）主容器用足量的吸附性材料進行 包裹，以便在發(fā)生滲漏時可以吸收所有液體。
（２）中 層包裝，為第２層耐用、水密性、防滲漏的包裝，把主 容器裝入其中并對其起保護作用。
（３）外包裝，中層 包裝置于外包裝內(nèi)，并加墊適宜的緩沖材料。外包裝 應(yīng)能保護其內(nèi)容物在運輸時不受外界的影響，如遭受 物理性損壞。外層容器的最小一面的尺寸≥１０ｃｍ× １０ｃｍ。將制備完成的樣本放置于特殊包裝箱中進行 相關(guān)貯存試驗。

１．２．３ 樣本貯存

把已接種菌液的幽門螺桿菌運輸 培養(yǎng)基分別置于４、２５、３５、－２５、－８０ ℃環(huán)境中，分別 存放６．０、１２．０、２４．０、４８．０ｈ后進行微需氧培養(yǎng)。

１．２．４ 樣本的運輸

汽車運輸：將標(biāo)本置于４ ℃冷 鏈運輸箱由本公司冷鏈運輸車運送至杭州金域醫(yī)學(xué) 檢驗所樣本接收組，并及時遞交至微生物室，所有樣 本存放總時間為７．０ｈ后接種。在車上時間為６．０ｈ。 火車運輸：將標(biāo)本置于４ ℃冷鏈運輸箱，通過安檢并 進行交接登記。當(dāng)日上午約９：００從杭州托遠(yuǎn)，至下 午１５：００左右樣本到達(dá)廣州高鐵站，由廣州運務(wù)組提 貨，在１６：００前交接進入廣州金域標(biāo)本組并及時遞交 至微生物室，所有樣本存放總時間為７．０ｈ后接種，在 車上時間約為６．０ｈ。飛機運輸：將標(biāo)本置于４ ℃冷 鏈運輸箱，通過安檢并進行交接登記，由杭州經(jīng)航空 運送到達(dá)廣州白云機場，并及時遞交至微生物室，所 有樣本存放總時間為７．０ｈ后接種。在空中時間約為 ２．５ｈ。

２ 結(jié)　　果

固體培養(yǎng)到第３天時，幽門螺桿 菌生長良好，哥倫比亞血瓊脂平板上見透明、針尖樣 菌落形態(tài)；液體培養(yǎng)第３天時可見培養(yǎng)基明顯渾濁， 涂抹少量菌液于無抗菌藥物的哥倫比亞血瓊脂平板 培養(yǎng)，肉眼未見污染菌生長，并有透明、針尖樣的菌落長出；在無菌生理鹽水中：革蘭染色后細(xì)菌為革蘭陰 性，固體培養(yǎng)基中的幽門螺桿菌為螺旋狀、海鷗狀、ｓ 狀彎曲菌或短桿菌；液體培養(yǎng)基中的幽門螺桿菌則多 為螺旋短桿狀，亦見部分長絲狀細(xì)菌，有的互相纏繞 聚集成團，有的散在分布，革蘭染色結(jié)果見圖１

樣本貯存溫度與存放時間對結(jié)果有非常顯著性影 響。在２４．０ｈ內(nèi)相同貯存時間以貯存４ ℃時培養(yǎng)陽 性率最高（４０．４％±５．１％），與其他各組比較差異有 統(tǒng)計學(xué)意義 （Ｐ＜０．０５）；在 貯 存 ６．０ｈ 以 內(nèi) 以 貯 存 ２５ ℃時陽性率最高（７１．２％ ±８．１％），與 ３５、－２５、 －８０ ℃比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０５）。不同貯 存時間以－８０ ℃結(jié)果最穩(wěn)定，結(jié)果見表１。

３ 討　　論 　　

幽門螺桿菌為革蘭染色陰性無芽胞、呈螺旋狀彎 曲的桿菌，不僅寄生于胃腸道，而且在口腔及呼吸系 統(tǒng)均分離到細(xì)菌，在人群中感染率達(dá)５０％以上。據(jù)報 道，幽門螺桿菌感染是消化系統(tǒng)慢性炎癥、胃部潰瘍、 胃黏膜淋巴組織異常和淋巴瘤的主要致病菌和胃癌 的一級致癌因子。目前對幽門螺桿菌感染診斷方法種類眾多，不同方法檢出的陽性率差異明顯，有許 多確定性方法如病理檢查、基因診斷等。但如果進 行致病機制、細(xì)菌分型、耐藥菌株、疫苗制備等研究， 幽門螺桿菌培養(yǎng)法是“金標(biāo)準(zhǔn)”。



 

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