大腦短暫缺血性損傷或再通可見于頭頸部手術出現(xiàn)的 并發(fā)癥，腦血栓形成后部分腦血管的自然再通或者藥物溶 栓再通也會出現(xiàn)缺血再灌注損傷。在腦缺血再灌注損傷 時，大腦缺血邊緣區(qū)( 半暗區(qū)) 細胞以凋亡為主要死亡方式， 及時的藥物干預可以抑制細胞凋亡，因此該區(qū)域為腦缺血 以及再通后重點搶救區(qū)域。而海馬區(qū)對缺血缺氧相當敏 感，及時搶救海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡，對保護海馬區(qū)的記憶、 學習功能有重要意義。

1 實驗材料

1. 1 動物

SPF 級健康 6 周齡雌性昆明種小鼠 33 只，體質 量 22 ～ 30g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物實驗中心提供，許 可證號: SCXK( 粵) 2013 － 0034。自由飲食飲水飼養(yǎng)，自然光 暗周期。

1. 2 藥物與試劑

三七總皂苷，云南玉溪萬方天然藥物有 限 公 司 提 供，規(guī) 格: 200mg /支，批 準 文 號: 國 藥 準 字 Z20026437; 兔抗小鼠 Bax 和 Bcl － 2 多克隆抗體，CST 公司 提供; SABC 免疫組化染色試劑盒，規(guī)格: 1kit，購自武漢博士 德生物試劑公司; DAB 顯色試劑盒( 20 × ) ，規(guī)格: 3ml，購自 北京索萊寶科技有限公司。

1. 3 主要儀器

光學顯微鏡( 日本 OLYMPUS 公司) ; 冰凍 切片機( 德國 LEICA 公司) ; 博迅SSW-600-2S電熱恒溫水槽( 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司) 。

2 實驗方法

2. 1 動物分組

將實驗小鼠隨機分為空白組( 7 只) 、PNS 組( 8 只) 、缺血 9d 組( 9 只) 、缺血 24h 組( 9 只) 。

2. 2 模型制備

PNS 組、缺血 9d 組和缺血 24h 組參照相關中的方法改進制備缺血再灌注模型。稱小鼠體質量， 腹腔注射水合氯醛( 0. 003ml /g) 麻醉小鼠，待小鼠無翻正反射 后，固定于手術臺上，常規(guī)消毒，頸部切開 0. 8 ～ 1cm 正中切 口，剪毛，切開皮膚和皮下組織，鈍性分離肌肉，暴露頸動脈 鞘，然后分離雙側頸總動脈及迷走神經(jīng)約 0. 5 ～ 1cm，并用絲 線穿過頸總動脈下方，提拉絲線，以動脈夾夾閉頸總動脈阻斷 血流 20min，然后去除，恢復灌注，最后縫合皮膚，消毒。

2. 3 給藥方法

PNS 組于缺血前 3d 開始腹腔注射 PNS 30mg /( kg·d) ，之后每天同一時間注射等體積 PNS，持續(xù) 至再灌注第 9 天后取腦。缺血 9d 組和缺血 24h 組均在造模 前 3d 以等體積的 0. 9% 氯化鈉注射液腹腔注射，之后每天 同一時間等體積注射 0. 9% 氯化鈉注射液，分別持續(xù)注射至 再灌注第 9 天和再灌注 24h 后取腦。空白組在缺血 9d 組造 模前 3d 以等體積 0. 9% 氯化鈉注射液腹腔注射，之后每天 同一時間注射等體積 0. 9% 氯化鈉注射液，持續(xù)注射至第 9 天后取腦。

2. 4 觀察指標

SABC 免疫組化方法: 獲得鼠腦后按冰凍 切片制作方法進行切片，厚度 30μm。按照 SA1020 － 小鼠/ 兔 IgG SABC 免疫組化染色試劑盒說明書進行染色，步驟 為消除組織內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復、封閉、孵育一抗、 孵育二抗、孵育 SABC、DAB 顯色、脫水、透明、封片。其中每 組腦片分別進行 2 次免疫組化染色，分別孵育 Bax 抗體( 工 作濃度 1∶ 800) 和 BCL － 2 抗體( 工作濃度 1∶ 1600) 。其中， DAB 顯色法步驟按照 DAB 顯色試劑盒( 20 × ) 說明書進行， 具體步驟: 將工作 A 液、B 液、PBS 液按 50∶ 50∶ 900 稀釋并混 合，室溫避光孵育切片 30min，在顯微鏡下觀察顯色，用蒸餾 水洗滌終止反應。 陽性細胞計數(shù): 在 200 倍光學顯微鏡下在腦組織切片的 海馬區(qū)內(nèi)隨機選取 5 個視野計數(shù)免疫組化染色陽性的細胞 數(shù)。并分別記錄每組切片 Bax 和 Bcl － 2 免疫組化染色陽性 的細胞數(shù)。

2. 5 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 19. 0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，2 組 間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準差( x ± s) 表示。P ＜ 0. 05 表示差異有 統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

各組小鼠海馬區(qū) Bax、Bcl － 2 表達水平比較: 與空白組比 較，缺血 9d 組 Bcl － 2、Bax 水平均明顯增高; 與缺血 9d 組比 較，PNS 組 Bax 的表達水平明顯降低，Bcl － 2 /Bax 的表達水平 明顯增高; 缺血9d 組 Bax 和 Bcl － 2 的表達均較缺血24h 組增 高; 差異均具有統(tǒng)計學意義。( 見圖 1、圖 2) 表 1 各組小鼠海馬區(qū) Bax、Bcl － 2 水平比較( x ± s，個) 組別 只數(shù) Bcl － 2 Bax Bcl － 2 /Bax 空白組 7 2. 94 ± 2. 15 4. 00 ± 4. 10 0. 92 ± 0. 52 PNS 組 8 7. 30 ± 3. 75 3. 35 ± 1. 81 2. 26 ± 0. 70cd 缺血 9d 組 9 27. 44 ± 19. 59abd 63. 44 ± 12. 77abd 0. 46 ± 0. 32 缺血 24h 組 9 0. 58 ± 0. 88 1. 58 ± 1. 44 0. 61 ± 1. 11 注: 與空白組比較，a P ＜ 0. 05; 與 PNS 組比較，b P ＜ 0. 05; 與缺血9d 組比較，c P ＜0. 05; 與缺血24h 組比較，c P ＜0. 05。


4 討 論

PNS 具有廣泛的藥理作用，實驗研究證實其不僅能抑制 炎癥因子、清除自由基、抗氧化應激，還能通過活血化瘀、擴 張毛細血管，降低血管阻力及血液黏度，改善微循環(huán)，對腦 缺血再灌注損傷有保護作用，因此可用于缺血性腦血管疾 病的治療。黃小平等將三七的 3 種有效成分人參皂苷 Ｒg1、Ｒb1 以及三七皂苷 Ｒ1 分別與黃芪甲苷配對，然后注入 腦缺血模型小鼠后發(fā)現(xiàn)，注入人參皂苷 Ｒg1 的小鼠腦組織 中一氧化氮含量明顯降低，說明人參皂苷 Ｒg1 具有抗腦缺 血的作用，對再灌注后氧化應激損傷的亦有明顯的保護 作用。



 

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯(lián)系我們，我們會在第一時間進行處理。