土霉素是１種廣譜抗生素，對(duì)立克次體屬、支 原體屬等 多 種 致 病 菌 具 有 強(qiáng) 的 抗 菌 作 用。然 而， 由于長(zhǎng)期以 來(lái) 土 霉 素 的 廣 泛 應(yīng) 用，臨 床 常 見(jiàn) 病 原 菌，例如葡萄 球 菌 等 革 蘭 陽(yáng) 性 菌 及 多 數(shù) 革 蘭 陰 性 桿菌，對(duì)土霉素耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。土霉素屬于四環(huán) 素類(lèi)的抗生素，其性質(zhì)穩(wěn)定，由于大量使用導(dǎo)致環(huán) 境中過(guò)多殘留（土壤甚至海洋），且不易被降解，造 成環(huán)境中藥物的嚴(yán)重污染。環(huán)境中的土霉素極 易引起耐藥菌的產(chǎn)生，對(duì)農(nóng)作物、牲畜乃至人類(lèi)產(chǎn) 生不利影響，人 類(lèi) 急 需 尋 求１種有效的方法對(duì)環(huán) 境中的土霉素進(jìn)行降解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

１．１ 儀器與試劑

超 凈 工 作 臺(tái) （蘇 凈 集 團(tuán) 安 泰 公 司 ）；ＺＳＤ－ Ａ１１６０全自動(dòng)新 型 生 化 培 養(yǎng) 箱（上海智城分析儀 器有限公司）；上海博訊YXQ-75SII型立式壓力蒸汽滅 菌鍋 （上 海 博 訊 實(shí) 業(yè) 有 限 公 司 醫(yī) 療 設(shè) 備 廠 ）； ＬＡＢＯＲＯＴＡ ４０００－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ 旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 儀 （德 國(guó) Ｈｅｉｄｏｐｈ公司）；ＡＬ１０４萬(wàn)分 之 一 電 子 天 平（瑞 士 Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ公 司）；ＪＥＯＬＪＮＭ－ＥＣＰ６００ 型 核磁共振波譜 儀（５００ ＭＨｚ）（日本 電 子 株 式 會(huì) 社）； ＡｇｉｌｅｎｔＤＤ２５００ ＭＨｚ（安捷倫科技有限公司）； ＴｈｅｒｍｏＤＳＱＥＩ－ｍａｓｓ型質(zhì)譜儀（美國(guó) Ｔｈｅｒｍｏ公 司）；高效液相色譜儀 ＨｉｔａｃｈｉＬ－２０００ ＨＰＬＣ，Ｈｉ－ ｔａｃｈｉＬ－２５４５檢測(cè)器（日本 Ｈｉｔａｃｈｉ公司）；Ｋｒｏｍａ－ ｓｉｌＣ１８柱 （５μｍ，２５０ ｍｍ×１０ ｍｍ，瑞 典 Ｅｋａ 公 司）；Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０ 凝 膠 柱 色 譜 填 料 （Ａｍｅｒ－ ｓｈａｍ 公司）；硅膠２００～３００目（青島 海 洋 化 工 有 限公司）；色譜 甲 醇（天 津 四 友 精 細(xì) 化 工 公 司）；土 霉素（上海麥克林）。

１．２ 菌株

真菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６）分離 自 中國(guó)廣西潿洲島珊瑚礁的海葵（樣品編號(hào) ＧＸＷＺ－ ２６），根據(jù)形態(tài)、理化特征及分子生物學(xué)方法，鑒定 該 菌 株 為 Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｌｕｎａｔｕｓ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登 錄 號(hào)：ＪＮ９４３４６２，現(xiàn)保藏于中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物教 育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。－８０ ℃超低溫保存。

１．３ 培養(yǎng)基

（１）ＹＴＳ 液 體 培 養(yǎng) 基：海 鹽 ３３ｇ／Ｌ，葡 萄 糖 ２０ｇ／Ｌ。
（２）ＰＹＧ 液體 培 養(yǎng) 基：酵 母 膏１０ｇ／Ｌ，蛋 白胨１０ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（３）甘 油培養(yǎng) 基：甘 油 ２０ｇ／Ｌ，酵 母 膏 １０ｇ／Ｌ，蛋 白 胨 １０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（４）淀粉 培 養(yǎng) 基：可 溶 性 淀 粉１０ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（５）甘露 醇培養(yǎng)基：甘露醇２０ｇ／Ｌ，麥芽糖２０ｇ／Ｌ，葡萄糖 １０ｇ／Ｌ，谷氨酸鈉１０ｇ／Ｌ，酵母膏６ｇ／Ｌ，磷酸二氫 鉀０．５ｇ／Ｌ，硫酸 鎂（ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ）０．３ｇ／Ｌ，海 鹽３３ｇ／Ｌ。（６）磷酸鹽培養(yǎng)基：酵母膏３．５ｇ／Ｌ，葡 萄 糖 ２０ ｇ／Ｌ，蛋 白 胨 ３．５ ｇ／Ｌ，磷 酸 氫 二 鈉 （Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１．２ｇ／Ｌ，氯 化 銨 ５ｇ／Ｌ，海 鹽３３ｇ／Ｌ。
（７）合成培養(yǎng)基：葡萄糖２０ｇ／Ｌ，硫酸 銨２ｇ／Ｌ，磷 酸 二 氫 鉀 １ｇ／Ｌ，硫 酸 鎂 （ＭｇＳＯ４ · ７Ｈ２Ｏ）１ｇ／Ｌ，氯化 鈉１ｇ／Ｌ，碳 酸 鈣２ｇ／Ｌ，海 鹽 ３３ｇ／Ｌ。
（８）ＰＤＡ 培養(yǎng) 基：馬 鈴 薯２００ｇ／Ｌ，葡萄 糖２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。
（９）察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉 ３ｇ／Ｌ，磷酸氫二鉀１ｇ／Ｌ，硫酸鎂（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０．５ｇ／Ｌ，氯化鉀０．５ｇ／Ｌ，硫酸亞鐵０．０１ｇ／Ｌ，蔗糖 ２０ｇ／Ｌ，瓊脂２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。ＰＤＡ 斜面培養(yǎng) 基：馬鈴薯２００ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，瓊脂２０ｇ／Ｌ，海鹽３３ｇ／Ｌ。

１．４ 土霉素生物轉(zhuǎn)化與產(chǎn)物分離

在無(wú)菌條件下，將菌株Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 在ＰＤＡ 斜面培養(yǎng)基中２８℃培養(yǎng)７ｄ。加入１０ｍＬ 無(wú)菌人工海 水，刮 下 斜 面 的 孢 子。固 體 培 養(yǎng) 基 平 板轉(zhuǎn) 化 時(shí)，在 每 個(gè) 平 板 中 加 入 ２００μＬ 濃 度 為 ２５ｍｇ／ｍＬ的土霉素 溶 液（使 用 丙 酮 溶 解）。待固 體培養(yǎng)基冷卻至４０ ℃時(shí)，向每個(gè)平板倒入２０ｍＬ 培養(yǎng)基，輕輕混勻。吸取２００μＬ 孢子液涂布至培 養(yǎng)基平板，２８ ℃靜置培養(yǎng)２１ｄ；發(fā)酵結(jié)束后，適量 的乙酸乙酯萃取３次，ＨＰＬＣ進(jìn)行分析檢測(cè)。 土霉素的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物大規(guī)模制備采用察氏 固體培養(yǎng)基，共８００個(gè)平板，２８ ℃靜置培養(yǎng)２１ｄ。 發(fā)酵結(jié)束后，用乙酸乙酯萃取３次，合并萃取液蒸 干得浸膏５．１ｇ。經(jīng)硅 膠 柱 層 析 分 離（石 油 醚－乙 酸乙酯，體 積 濃 度 １０％ ～１００％），獲得 ３ 個(gè) 組 分 （Ｆｒ．１～Ｆｒ．３）。Ｆｒ．２經(jīng)過(guò)半制備型 ＨＰＬＣ純化， 獲得化合物２（５．３ｍｇ）和３（３．８ｍｇ）。

１．５ 生物活性測(cè)試

采用微量稀釋法對(duì)化合物進(jìn)行抗細(xì)菌活性 測(cè)試。測(cè)試菌株包括：大腸桿菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、 白色葡萄球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｕｓ、金黃色葡萄 球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ 和銅 綠 假 單 胞 菌（綠 膿桿菌）Ｐｓｍｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ。環(huán)丙沙星為陽(yáng) 性對(duì)照，ＤＭＳＯ 為陰性對(duì)照，細(xì)菌培養(yǎng)基為空白對(duì)照。２８ ℃恒溫培養(yǎng)２４ｈ，使用酶標(biāo)儀測(cè)試６２０ｎｍ 波長(zhǎng)處 的 吸 光 度，獲 得 化 合 物 的 最 小 抑 菌 濃 度 （ＭＩＣ）。

２ 結(jié)果與討論

用９種不同的培養(yǎng)基對(duì)Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 進(jìn)行土 霉 素 轉(zhuǎn) 化 條 件 篩 選。ＨＰＬＣ 的 分 析 條 件： ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱，流動(dòng)相為甲醇（Ｂ）－水（Ａ），梯度 洗 脫：０～５ｍｉｎ，５％ Ｂ；５～１５ｍｉｎ，５％～２０％ Ｂ；１５～ ３０ｍｉｎ，２０％～３０％ Ｂ；３０～３５ｍｉｎ，３０％～１００％ Ｂ； ３５～６０ｍｉｎ，１００％ Ｂ。流速為２ｍＬ／ｍｉｎ；檢測(cè)波長(zhǎng) ２１０ｎｍ；進(jìn)樣量２０μＬ。ＨＰＬＣ指紋譜圖分析表明， 在察氏固體培養(yǎng)基（Ｓ１０）中獲得了較好的轉(zhuǎn)化效果 （見(jiàn)圖１）。


３ 結(jié)論

本研究利 用 海 洋 真 菌 Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 成功地對(duì)土霉 素 進(jìn) 行 了 生 物 轉(zhuǎn) 化，獲 得 了２個(gè) 未顯示抗菌活性的降解產(chǎn)物，表明海洋來(lái)源真菌Ｃ． ｌｕｎａｔｕｓ可有效降解四環(huán)素類(lèi)抗生素土霉素，為環(huán) 境中土霉素的生物降解研究提供了參考資料。

 

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